养NK细胞，大家都关心什么问题？这份NK培养的问题汇总解答，赶紧收藏起来吧！

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2024-09-19

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大家在NK细胞培养过程中最关心哪些问题？我们收集了这些问题并对它们进行了解答。这份NK培养的问题汇总解答，赶紧收藏起来吧！

1、细胞在正常培养到八九天后，细胞增殖忽然变慢，甚至停止增殖，但活率很高，是什么原因？

答：①入袋损失的细胞太多，具体表现于入袋时细胞转移不充分、培养基预温不到位、入袋后没有对折袋子、后期含有IL-2的培养基反复预温等原因；②前期接种量与试剂盒要求的范围相差过大。

2、每次培养之前需要FACS测试PBMC中NK的含量吗？若是含量在5%左右，算是正常样本还是属于特殊样本呢？培养NK之前，测PBMC中NK的含量是必须的吗？

答：最好是测一下，初始5%属于较难养的样本，若使用新濠新天地的标准版NK可能最终阳性率就会有60%~90%的较大波动，但使用高性能培养至90%阳性率以上问题不大。

3、血是什么抗凝保存运输的？

答：最合适的抗凝剂是肝素盐抗凝，但一般采集脐血用的是枸橼酸钠抗凝袋。

4、假设5E7的PBMC，培养到D16可以获得多少亿NK？纯度多少？需要多少培养基？目前使用的培养基可以容纳的最高培养密度是多少？可以达到3E6/mL吗？

答：5E7单个核细胞培养到D16一般可以获得70亿以上细胞数，纯度90%以上，使用2.2L培养基。目前的培养基可以最高承载6.2E6/mL的细胞密度（客户案例）。

5、吸白膜层第一次清洗用700g离心，10min，升9，降9。这个离心条件是否会损害细胞？

答：经过新濠新天地多次测试、工艺优化，700g离心不会对细胞活率有明显影响。

6、血小板裂解物和血替有什么区别？

答：血小板裂解物就是指血清替代物，都是人源血小板裂解后的产物，通过生产级别区分GMP级与科研级。

7、脂血样本的处理方法是什么？

答：血脂不明显的样本，自体血浆可直接使用。若出现明显胶质或不透明自体血浆，建议使用血清替代物代替自体血浆添加。

8、细胞接种时，接种密度稍大一些会有什么不良影响吗？

答：密度稍大一些没有较大影响。若接种密度明显高出试剂盒范围，则会导致细胞和因子结合不充分，细胞数和阳性率可能还不及密度在合适范围接种。接种密度：新鲜外周血：1.5E6~2E6 cells/mL；新鲜脐血: 3E6~3.5E6 cells/mL；冻存外周血：活细胞2.5~3E6 cells/mL；冻存脐血、长距离运输脐血: 3.5E6~4E6 cells/mL。以上特殊样本接种是要高于正常样本，用数量换取质量。

9、细胞培养到第7天需要入袋吗？

答：正常补液情况下是Day7入袋，若出现延迟补液可能Day9才能入袋。

10、细胞量不够的时候可以减少培养基的量吗？

答：出现明显不够的情况可以按照接种密度，略微调整培养基添加量。如T75体系正常添加30mL培养基，调整为20mL培养基，但最好的方案是同时备上T25版本（AN0104）和T75版本（AN0104-2）试剂。

11、外周血要裂红计数吗？

答：一般没有必要。

12、为啥新鲜的外周血和脐血分离的PBMC，接种密度有差异呢？

答：首先是因为脐血先天比外周血中细胞增殖较慢，前期提高接种量加大细胞间的相互作用。第二是脐血接种会引入大量杂细胞，实际上可激活的单个核细胞远低于我们计数出来的细胞，要用数量换取质量。

13、运输血液样本的注意事项是什么？

答：2~8℃温度尽量稳定，同时使用转运箱，避免血样有剧烈震荡。

14、新濠新天地本次实验采用的特殊样本细胞计数多少？

答：新濠新天地本次实验采用的特殊样本总体积100mL血分离1.2E8单个核细胞，而正常新鲜样本分离3~4E8单个核细胞。

15、血浆为什么是红色的？

答：出现了溶血。

16、为什么叫修复培养基（NC0102.F），有什么作用？

答：免疫修复培养基是高性能套装中的核心产品，本质上使受损或质量不佳的单个核细胞能够更好地结合细胞因子，让激活收到影响的细胞尽可能快速回归正常的激活轨道，配合后续的扩增培养基能够实现“先修复后激活” 的使用原理。

17、包被后的培养瓶最长可以放多长时间？

答：正常包被是37℃ 2h，若包被完成后不使用可以将包被液倒掉加入DPBS放入2~8℃保存，12h以内使用。

18、包被是什么目的？

答：①提供初始的激活环境；②尽可能压制CD3+细胞群。

19、PBMC的最低接种量多少？

答：最低是1.5E6/mL。

20、DPBS可以换成PBS吗？

答：不含钙镁离子的DPBS或PBS都可以，生理盐水也可以。

21、为什么脐带血一定要稀释？

答：尽可能减少分白膜层时红细胞引入进单个核细胞层。

22、本次实验用的是新濠新天地FEP细胞培养袋吗？

答：是的，新濠新天地FEP细胞培养袋，相较于传统EVA材质，气体交换面积大，相同培养体系下一般可获得30%以上细胞数量提升。FEP为100%惰性材质，可以耐受大多数有机溶剂和酸碱介质的腐蚀，无细胞和组织毒性，可在-196°C（液氮）到+137°C（高压灭菌）之间保持柔韧度。玻璃般透明的高透光材质，易于观察细胞状态。

23、脐血样本，没有自体血浆用什么代替呢？添加量是怎样的？

答：若出现外周血自体血浆质量不佳或者脐血血浆抗凝剂比例过高的情况，可使用血清替代物或优质胎牛血清作为自体血浆平替，添加量同自体血浆量相同。品牌需私下咨询新濠新天地技术或销售。

24、灭活血浆的方法是什么？

答：56℃水浴30min。

25、200mL采血袋，只采了50mL脐带血，再分离的时候是否有影响？

答：有影响，会导致分离得到的血浆质量不佳。为了避免抗凝剂占比过高影响自体血浆的使用，应使脐血中的抗凝剂占比低于30%。如用采血袋采集血样，建议使用100mL容量的采血袋。如果采血时用200mL采血袋，建议取出14mL抗凝剂。

26、冻存PBMC复苏培养，冻存的密度多少合适？

答：若使用新濠新天地单个核细胞专用冻存液，冻存密度建议3E6~2E7个细胞/mL。

27、血浆灭活后是否需要低温静置，待蛋白析出？

答：需要低温静置，56℃灭活后放-20℃冰箱，急冷15min即可。

28、NK细胞培养过程中，可能会造成阳性率不高的因素有哪些？

答：①样本质量不佳，分离出单个核细胞中NK细胞比例低，CIK比例高；②转瓶、入袋损失的细胞太多，具体表现于转瓶、入袋时细胞转移不充分、培养基预温不到位、入袋后没有对折袋子、后期含有IL-2的培养基反复预温等原因。